rpa相关酶
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification, rpa)是一种多酶协作的反应体系,详细原理可参考充满---力的恒温扩增技术:rpa、rca、sda、hda。该体系反应酶包含三种:重组酶:可与引物结合形成复合体,基础型wlre8208kit试剂盒,定位至与引物同源的靶序列,促使引物与模板结合,同时帮助dna解链,基础型wlre8208kit试剂盒公司,以便启动扩增;单链dna结合蛋白:可与被置换出的dna单链结合,稳定单链结构;dna聚合酶:如bsu dna聚合酶,用于dna链合成,同时具有链置换功能。对于rna模板,需在反应中加入逆转录酶形成rt-rpa体系;若利用标记探针进行检测,还需加入---酶对探针序列进行切割,常用---酶有---内切酶 iv(endonuclease iv, nfo)和---外切酶 iii(exonuclease iii, exo),或者可与crisps/cas系统搭配使用。
尿dna糖基化酶尿dna糖基化酶(udg酶)又称尿-n-糖基化酶(ung酶),可水解含尿的单链和双链dna释放出游离尿,而对rna无活性,与dutp搭配使用,可建立成pcr防污染体系。其原理如下:在pcr体系---dttp部分或全部替换为dutp后,使得反应生成含有du碱基的扩增产物,这些扩增产物不同于天然模板,在进入含有udg酶的反应体系时,可被udg酶识别并切割尿碱基与糖磷酸骨架间的n-糖基键,而经切割后的dna链在碱性或高温条件下易于断裂降解,从而失去被当作模板再扩增的能力,因此可防止扩增子污染(如下图)。市面上的udg酶主要有普通型和热敏型,其中热敏型udg酶在室温条件下即可催化反应,50℃以上加热可使其灭活,防止其降解后续pcr形成的含du扩增产物。虽然udg/dutp体系具有防污染功能,但在实际测试中还得---pcr的效率和灵敏度。一方面需---pcr扩增产物掺入足够量的尿碱基,从而可被udg有效切割;另一方面也需要---反应体系添加的dutp不会明显影响pcr效率,因此dttp和dutp的佳比例需通过优化确定。
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